RFLP

Hybridization-based marker – RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) berasal dari susunan DNA yang terjadi karena proses evolusi, mutasi titik pada situs enzim restriksi, insersi atau delesi dalam fragmen DNA. Dalam analisis RFLP, genomik DNA yang dipotong dengan enzim restriksi dipisahkan melalui gel elektroforesis, dan diblot ke membrane netroselulase. Dasar dari transfer DNA dari gel ke pensupport yang lebih solid adalah untuk mengawetkan posisi fragmen DNA dan menyebabkan hibridisasi dapat dilakukan. Pola banding yang spesifik divisualisasi dengan hibridisasi dengan probe yang dilabel. Probe biasanya probe lokus tunggal yang spesies-specific berukuran 0.5 – 3kb yang diperoleh dari cDNA library atau genomik library.

RFLP merupakan marker co-dominant. RFLP merupakan marker yang sangat dapat dpercaya dalam analisis linkage dan breeding dan dapat ditentukan dengan mudah jika karakter terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot. Kekuatan dari marker RFLP adalah konsistensi yang tinggi, sifat pewarisan co-dominant, dapat diulang antar laboratorium, memberikan marker yang locus-specific, tidak memerlukan informasi sekuen, dan relative mudah discor karena perbedaan yang besar antar fragmen. Tetapi penggunaan RFLP memerlukan DNA dalam jumlah yang besar untuk pemotongan dengan enzim restriksi. Di samping itu penggunaan isotop radioaktif relatif mahal dan berbahaya. Waktu yang diperlukan juga cukup lama.

RLFP didasarkan pada polimorfisme yang muncul karena adanya basa yang mengalami substitusi, penambahan, pengurangan dan perpindahan (translokasi) pada genom DNA.  Perubahan tersebut menyebabkan perbedaan ukuran dari fragmen restriksi yang dicerna oleh enzim restriksi tertentu.  RFLP hanya mendeteksi perbedaan-perbedaan dari fragmen tersebut, dimana satu dengan lainnya berhubungan dengan homolognya dari probe molekuler yang digunakan dalam hibridisasi.  Probe molekuler yang digunakan untuk RFLP antara lain probe genom DNA (yang diturunkan dari genom DNA) dan probe cDNA (yang diturunkan dari mRNA).  Kelebihan dari RFLP adalah dapat mendeteksi sifat co-dominan, artinya dapat membedakan antara yang homosigot dan heterosigot.  Selain itu kelebihan yang lain adalah diharapkan didapatkan homologi polimorfik.  Genom-genom inti dari eukariot mengandung pengulangan urutan basa sekitar 2-15 pasang basa yang merupakan suatu motif yang tersebar sepanjang genom yang disebut dengan dispersed repetitive DNA (drDNA) atau variable number of tandem repeats (VNTRs).  Oleh karena itu, urutan yang berulang ini dapat digunakan sebagai probe multilokus yang mempunyai polimorfisme berbagai lokus secara simultan.(Bardakci, F. 2001. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Turk J Biol 25:185-196

Semagn, K., Bjørnstad, A., Ndjiondjop, M.N. 2006. An overview of molecular marker methods for plants. African Journal of Biotechnology 5: